一、RAW264.7细胞株传代处理

1. 收到细胞后，75%酒精消毒，置于细胞培养箱中静置2-3h，以稳定细胞状态；

2. 观察细胞生长情况，细胞密度低于80%时，贴壁细胞倒去瓶中培养液，留下8ml作用继续培养；细胞密度大于80%时，即可进行传代；

3. 培养瓶内培养液收集，留3ml左右，轻轻拍打瓶底，用吸管吹打，将细胞吹打成细胞悬液（无需用胰蛋白酶消化）或者用细胞刮板轻轻刮下来；

4. 收集细胞悬液至离心管内，1000rpm离心5min，观察细胞沉淀；

6.加入1ml的完全培养液，轻轻吹打成单细胞悬液，均匀分配至细胞培养瓶中，初次传代建议按照1：2比例进行。

二、RAW264.7细胞株诱导处理

1. 使用37℃预热的破骨诱导分化培养基（货号：CCTCC-Y005）重悬细胞，按照5000~20000 cells/cm2密度进行铺板，48孔板培养基体积建议400-500μL。

2.细胞每隔1d全量换液一次，每次换液前破骨诱导分化培养基应37℃预热

3. 诱导分化4-10天，可观察到成熟的多核破骨细胞。

注意事项：以下情况都会造成破骨诱导不成功或者破骨分化效率低

（1）RAW264.7细胞分化程度过高，即未诱导时伸出伪足的细胞比例过高

（2）接种密度不恰当

（3）长时间在培养箱外观察

（4）实验时诱导分化培养基未预热

（5）诱导分化培养基保存失当，反复温浴和冷藏交替

细胞样本(以 48 孔板为例)：

1. 移除细胞培养液，每孔加入 400μL 1 号洗涤液（货号:CTCC-JD005）清洗，弃液；

2. 每孔加入 300μL 固定液，室温固定 15-30min，弃液；

3. 每孔加入 300μL 2 号洗涤液，清洗 2 次；

4. 染色：每孔加入 150-200μL TRAP 染色液，37℃避光孵育 10-15min(待测样品中酒石酸酸性磷酸酶活性较低时，可适当延长孵育时间至 30 分钟或显微镜下显色至预期深浅)。

5.每孔加入 300μL 2 号洗涤液，清洗 2 次；

6.显微镜下观察和拍照；

7.每孔加入 300μL 保存液，4℃放置，可保存一周。

1、为什么有的人诱导4天就成破骨了而我需要7天甚至更久呢？

诱导周期是动态的过程，要结合诱导过程中细胞状态来。看前期是否出现过破骨又碎掉，如果是碎过一轮了，那就没必要诱导了。如果至整个诱导周期中首次出现破骨，且细胞整体汇合度还比较低的情况，还是可以持续诱导的。

2、我诱导成功了什么时候进行染色最适合呢？

诱导成功后立即进行染色，破骨成熟期只有24小时 24小时后破骨会破碎。