操作步骤

一、爬片准备

1、根据实验选择合适大小的爬片。

2、爬片处理，首先浸酸：5%稀盐酸浸泡过夜（最好逐片浸入，多片同时浸入会引起多片粘连、浸洗不充分），第二天先用自来水冲洗20次，再用三蒸水冲洗2次（清除残留酸液）。

3、将爬片置于无水乙醇浸泡过夜（浸洗脂类污渍），75%乙醇长期保存备用（无需高压灭菌）。使用时镊子取出爬片，酒精灯烘烤，放入孔板。

二、细胞爬片

1、收集贴壁细胞进行计数，按照实验需求用完全培养基稀释细胞至合适浓度。

2、加细胞前，先在每个孔里准备放爬片的位置滴加少量培养基（目的是使爬片与培养皿靠液体的张力粘合到一起），然后轻放爬片（注意不要产生气泡，防止加细胞悬液时爬片漂起）。整个过程注意无菌操作。

3、根据实验需求接种合适细胞量到培养器皿内。

三、爬片的固定

固定液的选择：

1）多聚甲醛（常用4%）：

可用于免疫电镜、免疫组化、免疫荧光以及TUNEL染色等。室温固定15~30 min后可进行后续实验。

2）4%中性甲醛：

又名“10%中性福尔马林”，应用广泛，常用于免疫组化、免疫荧光以及TUNEL染色等。形态结构保存好，且穿透性强，但甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露，可能造成假阴性的染色结果。室温固定15~30 min后可进行后续实验。

以多聚甲醛为例进行固定：

1、准备4%多聚甲醛（PFA），于4℃冰箱中保存，使用时常温复温。

2、在培养板中将已爬好细胞的爬片用PBS浸洗3次，每次3 min，轻轻晃动，避免将细胞冲掉。

3、用4%的多聚甲醛固定爬片15 min（细胞自带荧光时注意避光），PBS浸洗爬片3次，每次3 min。

4、Triton X-100（PBS配制，浓度根据实验调整）室温通透20 min。

5、PBS浸洗爬片3次，每次3 min。

6、按实验需求进行后续实验。

四、细胞爬片封片

封片前根据实验需求决定是否需要孵育抗体或复染核。孵育好后用PBS浸洗3次，用吸水纸吸干爬片上的液体，封片液封片。

注意事项

固定好的细胞爬片建议尽快用于实验，以免影响实验效果。

取爬片时注意控制力度，夹取时尽量夹取爬片边缘，以免夹破爬片或造成划痕。

细胞爬片取出后，一般用PBS润洗3遍（润洗操作尽量轻柔，以免细胞脱壁；根据研究目的，可调整润洗次数，避免细胞脱壁），然后做固定。

对于贴壁性较差的细胞，可提前用包被液（明胶，多聚赖氨酸，鼠尾胶原等）包被爬片。

如果细胞带有荧光标记，所有操作步骤尽量在较暗处进行。

常见孔板细胞爬片（圆形）大小参考：