Seahorse 细胞能量代谢检测实验常见问题说明

步骤：

Seahorse 细胞能量检测的实验操作在细胞类型（贴壁或悬浮）、细胞数量、药物剂量浓度上均可能会有区别，需要在实验过程中进行调整，以下为贴壁细胞的一种线粒体压力测试方案：

一、准备工作

1. 接种贴壁细胞：将细胞接种在 XF96 细胞培养板上，每孔 80 μL 培养基，细胞数在 5~20 k/well 为佳，待细胞放入培箱中培养固定 1 h 后，再向每孔加入 70μL 培养基；在背景校正孔中加入 150 μL 培养基，不加细胞；将细胞培养板放入 37 ℃ CO2 细胞培养箱中培养过夜；

2. 水化探针板：在水化板（Utility Plate）中加入 200 μL/孔的无菌水，再放上探针板和盖子，轻微移动排出气泡后，在 37 ℃ 无 CO2 细胞培养箱中过夜；同时取出至少 20 mL 的 XF 校准液放入离心管中，37 ℃ 无 CO2 细胞培养箱中过夜；

二、上机检测

1. Seahorse Xfe96 系统预热：至少提前 5 小时打开仪器、电脑和软件进行预热；

2. 水化探针板：次日去除探针板装置，弃去 Utility Plate 中的无菌水，每孔加入 200 μL XF 校准液，放上探针板和盖子后，在 37 ℃ 无 CO2 细胞培养箱中水化 45~60 min；

3. 配置检测液：配置方法按试剂盒说明书进行，并根据实验需求进行调整；简而言之，一块培养板配置约 100 mL 检测液（97 mL 103575-100 试剂盒中加入 1 mL glucose（终浓度为 10 mM）、1 mL pyruvate(终浓度为 1 mM)、1 mL glutamine(终浓度为 2 mM)），调整检测液 PH 至 7.4，然后将使用 0.22 μm 细胞滤器过滤后放入 37 ℃ 温育备用；

4. 细胞换液：弃去细胞培养板中的培养基（留下 20 μL 覆盖细胞），加入 200 μL 检测液清洗 2 遍，彻底去除检测液，再加入 180 μL 检测液，将细胞放入 37 ℃ 无 CO2 细胞培养箱中 60 min 等待上机；

5. 配药：从试剂盒中取出一包药物，用检测液进行稀释，具体见下表

（图源网络）

推荐 Oligomycin 上机终浓度为 1.5 μM，Rot/AA 上机终浓度为 0.5 μM，FCCP 上机终浓度为 0~2 μM，2~3 mL 药物工作液为 10x 浓度装载入探针板，例如：想获得终浓度为 1.5 μM 的 Olygomycin，需加入 630 μL 检测液重悬，混匀后从重悬液中取出 450 μL 并加入 2 550 μL 检测液配置 3 mL 15 μM 的工作液；

6. 加药：探针板中每孔加入 20 μL 配制好的药物，加药时保持探针板水平，枪头略倾斜于探针板，枪头深入孔中但不能没入液体，药物不能挂壁；加药顺序为：（实验所需细胞药物）-Oligomycin-FCCP-Rot/AA。

（图源网络）

7. 上机运行：根据实验设计完成组定义设置，StartRun 运行实验，按照提示将去掉盖子的探针板防止于托盘上，进行校准（约 20 min）；校准完毕后将 Utility Plate 换成细胞培养板，并开始进行细胞能量代谢测试，测量结束后点击 Eject 取出细胞培养板和探针板，并对数据进行归一化处理。

注意事项

细胞状态最为重要，需要培养好细胞；贴壁细胞贴壁后细胞汇合度达 80~90% 为佳，并且细胞数量与药物浓度之间的比例需要把控好，做到能够检测到合适范围的氧耗率或产酸率，又不会过度抑制细胞活性。

常见问题

1. 探针板的水化时间？

4~72 小时，建议过夜。

2. 检测液中可以加入血清吗？

不建议加入，血清会影响检测液的缓冲能力，也可能与药物发生非特异性结合而影响检测效果。

3. 溶好的药物可以使用多长时间？

药物和检测液建议现用现配。

4. 加入 FCCP 后，OCR 没有升上去？

需要考虑是否细胞活性不佳，或者 Oligomycin 加入过多抑制了最大呼吸。

5. FCCP 剂量摸索如何设置？