一、   实验原理：

       CRISPR/Cas9 源自细菌及古菌中用以抵御病毒和外源 DNA 入侵的免疫调控系统 。 crRNA（ CRISPR-derived RNA） tracrRNA（ trans-activating RNA） 配对形成复合物能 特异识别基因组序列 ， 引导 Cas9 核酸内切酶对目的片段进行切割 ，对这两种 RNA 进行二 合一优化获得 sgRNA（ single-guide RNA） 同样能引导 Cas9 进行靶向切割。利用其特异 性靶向功能 ，可实现基因的精准编辑 ，包括基因敲除、敲入和点突变等等。该系统已被广泛 应用于斑马鱼、小鼠、大鼠、秀丽隐杆线虫、植物及细菌等多种生物体的基因编辑。

         CRISPR-Cas9 系统编辑切割产生 DNA 双链断裂（ Double-Strand Breaks, DSBs） ,可 诱 发  DNA 的 自 然 修 复 机 制 。 双 链 断 裂 的 DNA 一 般 通 过 非 同 源 末 端 重 组 （ Non- homologous End Joining-NHEJ）或者同源重组修复（ HDR）方式进行修复。非同源末端 连接（ Non-homologous End Joining-NHEJ)是真核生物细胞在不依赖 DNA同源性的情 况下 ，而为了避免 DNA 或染色体断裂（ Breab ，产生功能性敲除。具体原理如图所示：

二二、项目描述：

客户提供 RAW264.7 细胞，针对基因 AMPK（ Gene ID: 105787）进行功能性敲除 ，获得 多克隆细胞系。

三、实验材料：

1 ．细胞株

RAW264.7 细胞 ：公司提供。

2.主要试剂：

1   胎牛血清（ OPCEL）

2   DMEM（gibco）

3   0.25% Trypsin-EDTA （gibco）

4   PenStre双抗（gibco）

5   TIANamp Genomic DNA Kit （ TIANGEN）

6   2x EasyTaq PCR SurperMix（ Trans）

3.  仪器耗材：

1   生物安全柜 ：Thermo

2   二氧化碳培养箱 ：Thermo

3   荧光显微镜： Nikon

4   低温冰箱： Haier

5   -80℃冰箱 ：Thermo

6   细胞培养皿： Costar

7   低温高速离心机 ：Thermo

8    PCR 仪 ：Thermo