一 、小分子SM Pull down的核心思路

1.体外标记法

        分子化合物在体外偶联修饰生物素分子，不同的小分子化合物结构不同，标记修饰策略和难度各不相同，结构简单的可以直接反应，结构复杂的可能需要进行衍生化后修饰。

步骤一：标记修饰生物素的小分子与蛋白裂解液充分孵育，有些项目中会分离特定的细胞器，仍如核蛋白、线粒体蛋白、叶绿体面白等；同时会使用非标记的等量的小分子化台物和游腐的生物 分子作为对照组平行试验。

步骤二：链霉亲和素(Streptavdin  SA)的磁珠特异性的捕获生物数分子，与小分子结台的蛋白会被同时亲和纯化洗脱，通过SDS-PAGE 检测(便用员数度更高的惯染)不同组别的蛋白差异情

兄.

步骤三：洗脱下的蛋白先经胰蛋白酶消化成肽段，肽段在质谱仪中离子化后使用液质联用技术(LC-MS/MS )结台数据库检索可以进行蛋白定性，从而明确与小分子化合物结台的潜在配标蛋白列

表。

2.生物正交法

       将小分子药物进行炔烃修饰，添加至细胞或组织中，甚至是实验动物体内，待药物分子与靶点蛋白充分结合，提取蛋白裂解液，通过点击化学反应，将叠氮生物素与小分子药物连接， 最后使用与体外标记法一样的策略，通过链霉亲和素捕获生物素分子，最终鉴定靶点蛋白。

二、案例展示(部分图片)

1、小分子偶联反应实验方法及结果(示意图)                            2、小分子表征检测 

                                                                                                                质谱                                核磁氢谱

3、小分子Pull down                                                             4、小分子配标蛋白发现

                                                                                  三、方法学评价

优势：

1、相对于蛋白质芯片技术、小分子靶向蛋白分子显像技术，蛋白(多肽)展示文库筛 选技术，小分子pulldown实验操作简单，周期短，成本低廉。

2、小分子与蛋白大多数为共价结合，特异性较强，结台累密，实验结果复现率高，下游验证结合阳性概率较大。

3、液质联用技术(LC-MSMS)灵敏度可达pg级别，极其微量的蛋白能被分析出来

劣势：

1、小分子结构简单且多样，结构即功能，修饰生物素的小分子，功能有可能发生变化，其结合的靶点蛋白与天然小分子发生偏移。

2、偶联后的小分子化台物，如果要检测偶联效率和正确率，例如核磁共振或质谱法，

所耗费的代价可能高于偶联实验本身的成本.

3、质谱检测富集蛋白虽然灵敏，肽段的定位依据生信分析，只能实现初步的定性。