小鼠小肠类器官构建还需另外准备的试剂及耗材：
试剂： Mouse small intestine Organoid Kit/ Medium（小鼠小肠类器官分离培养试剂盒/培养基）、PBS （不含 Ca+ 、Mg+）、DMEM/F12 培养基
耗材：24 孔细胞培养板(非 TC 处理)、35mm 直径细胞培养皿、50ml 离心管、1.5ml 离心管、1ml 枪 头、200ul 枪头、巴氏吸管、眼科剪、眼科镊（所有耗材均需使用无菌，或需自行灭菌处理）。
小鼠小肠类器官构建
预准备
1. 根据培养需求量，将小鼠小肠类器官培养基提前解冻；
2. 根据培养需求量，将组织消化液 B 提前解冻；
3. 将准备好的基质胶提前放置在 4℃冰箱提前过夜解冻；
4. 将 5ml P1 加入 500ml PBS（不含 Ca+ 、Mg+）中，配制成 Buffer P1 ，并先放于 4℃冰箱预冷；
5. 将 3ml P2 加入 100ml 中 DMEM/F12 培养基，配制成 Buffer P2 ，并先放于 4℃冰箱预冷；
6. 将 24 孔细胞培养板（非 TC 处理）提前 2h 置于 CO2 培养箱中预热(5% CO2 ，37 °C)；
7. 巴氏吸管、枪头提前放于 4℃冰箱预冷；
8. 备好碎冰——转移基质胶从冻箱到超净工作台或生物安全柜，以防基质胶升温提前凝固。
小鼠小肠类器官构建操作
1. 处死小鼠（5 周大小），取 15cm 小肠段；
2. 在 100mm 直径细胞培养皿中加入 Buffer P1 ，将小肠放置于培养皿中，除系膜，去除粪便，用剪 刀剖开，用冰 PBS 反复清洗，进一步去除粪便, 用剪刀切成 3~5 mm 小块；
3. 将组织碎片转入 50ml 离心管中，让组织在重力作用下沉降，去除上清，加入 Buffer P1 清洗 10-15 遍，直至上清液清澈；
4. 向装有清洗过组织碎片的 50ml 离心管中加入 10ml 组织消化液 D ，旋盖后用封口膜封口置于含有 碎冰的泡沫箱中摇床旋转30min；
5. 静置沉降，去除上清，加入 10ml Buffer P2 ，用巴氏吸管轻轻吹打，静置沉降，上清 70uM 过筛， 标记为 1 ；加入 10ml Buffer P2 ，用巴氏吸管轻轻吹打，静置沉降，上清 70uM 过筛，标记为 2；； 加入 10ml Buffer P2，用巴氏吸管轻轻吹打，静置沉降，上清 70uM 过筛，标记为 3；加入 10ml Buffer P2 ，用巴氏吸管轻轻吹打，静置沉降，上清 70uM 过筛，标记为4；
6. 200g 4℃离心 5min 去除上清，再用 1ml Buffer P2 重悬；从 1,2,3,4 上清中吸取 10ul 到 35mm 孔板 中观察隐窝数量，取隐窝较多细胞碎片较少的编号，重悬取上清 10ul 计数；
7. 取隐窝数约为 2000 个/孔，200g 4℃离心 5min 去除上清，加入相应体积的小鼠小肠类器官培养基 混匀成细胞悬液，再加入基质胶，按 1:1.5 比例混匀；
8. 取出预热的 24 孔细胞培养板(非 TC 处理) ，每孔加入 50ul 混合液，放入 37℃培养箱 5min ，再把 培养板倒置 20min ，让细胞悬液和基质胶混合物进行凝固；
9. 凝固后每孔加入 500ul 小鼠小肠类器官培养基，置于细胞培养箱中进行培养，每天观察类器官生 长情况，每隔 1 天更换培养液。
小鼠小肠类器官传代（根据消化后的细胞沉淀量进行 1:2-1:5 传代）
1. 小心吸出孔中的类器官培养基，每孔加入 1ml 类器官传代消化液 B ，用 1ml 移液枪吹散基质胶， 转移到 15ml 离心管中，多个孔何必混合到一管中，加入类器官传代消化液 B 到 10ml ，旋盖后用 封口膜封口置于含有碎冰的泡沫箱中摇床旋转30min；
2. 300g 4℃离心 5min ，去除上清；
3. 加入 10ml 预冷的 Buffer P2 重悬，300g 4℃离心 5min ，去除上清；
4. 加入相应体积的小鼠小肠类器官培养基混匀成细胞悬液，再加入基质胶，按 1:1.5 比例混匀：
5. 取出预热的 24 孔细胞培养板(非 TC 处理) ，每孔加 50ul 混合液，放入 37℃培养箱 5min ，再 把培养板倒置 20min ，让细胞悬液和基质胶混合物进行凝固；
6. 凝固后加入 500ul 小鼠小肠类器官培养基到 24 孔细胞培养板(非 TC 处理) ，置于细胞培养箱中 进行培养，每天观察类器官生长情况，每隔 1 天 更换培养液
小鼠小肠类器官典型生长明场图
1）形态观察
2）HE 染色
3）IF 检测肠道标志物 Lyz 、E-CAD 的表达
